protocol-抗肿瘤细胞试验操作细节：
1、 准备工作：提前一个小时开台子照紫外灯，打开水浴锅调至37℃。
2、 穿无菌工作服，风淋，戴乳胶手套，手套包裹住衣袖。
3、 将胰酶、细胞培养基从-20℃冰箱拿出放37 ℃水浴锅。PBS（+）PBS（—）室温放置。
4、 观察细胞：打开显微镜，喷洒酒精于手套及棉花，棉花先擦拭显微镜台面，再擦桌面（所有培养皿可能接触到的地方），防止皿底染菌污染培养箱。
5、 从细胞培养箱中拿出培养皿，打开箱门时不可讲话，尽量摒住呼吸。手不可触摸皿底，捏住边缘，大拇指与中指捏边缘，食指扣皿盖。
6、 培养皿放显微镜下，调节焦距至视野清晰。观察细胞生长情况，数目多少，一般圆的细胞为正在分裂或漂浮移动的死细胞，不规则的带棱角的细胞正贴壁生长。看细胞之间的间隔距离。如果打开电脑使用照相软件，拉开目镜下面的拉杆。软件照相：
7、 首先将PBS、胰酶和培养基喷洒酒精后放入无菌工作台，从水浴锅拿出时用纸巾擦干，（进台子前都需要喷洒酒精）照紫外灯约三分钟。
8、 PBS（+）表示PBS中添加有EDTA，螯合离子，有利于消化酶的作用，通常用于消化之前的洗涤处理，PBS（—）则没有添加EDTA，通常用于细胞只需换液前的洗涤，但如果有需要用到PBS（+）时，可以用PBS（+）代替PBS（—）进行换液前的洗涤。
9、 培养基，各种癌细胞使用不同的培养基，一般都添加了抗生素，具备抑菌作用，新鲜培养基为桃红色，内有指示剂，当培养细胞后颜色会逐渐变黄色。UV照射约3min。
10、酒精喷洒一块棉花，从培养箱拿出培养皿，打开无菌台罩（到刻度线附近才会停止警报），棉花将台面擦干净，注意棉花不要扔弃在台内外部的抽气孔处，防止吸入发生堵塞。
11、脚踢开抽废液的泵开关。
12、打开装吸管和移液管的筒盖，拧开所有将要使用到的瓶盖，用的时候揭开，用完立即盖上，但不旋紧（盖子一般用锡箔纸包裹，如果没有，则用封口膜封口）。
13、倾斜筒子，拿尖头镊子夹出灭菌处理过的吸管（移液管），夹出一半，放下镊子，手拿出，（轻拿轻放）一定是捏住右手管口处，不可碰到管尖处，手不可挡住吸管视野，刻度正对着自己，管口插入吸废液管头，插入深度适中。无刻度的吸管用于抽弃废液，有刻度的移液管用移液枪移液，用完后，可用于抽弃废液，提高利用率。装了棉花的移液管抽弃废液时拿去棉花。
14、左手揭开皿盖，借助小指和中指依托皿底，手指不可触摸皿盖内侧，往外低倾斜，吸去废液。右手拔出吸管，堆放废液缸旁。
15、镊子夹出取出移液管，垂直插入移液枪枪头内，插紧，按钮为上吸下放，控制吸、放速度，移液管管口有棉花，防止液体吸入枪头，若枪头内有棉花，用镊子夹出。
16、实验完毕后，将抽废液管短时蘸入84消毒液罐，清洗消毒抽废液管，将泵开关关掉。
17、收拾工作台，清理垃圾。酒精擦桌面，关显微镜，罩上罩子。关水浴锅。
18、风淋的两扇门不能同时打开。
19、用过的离心管在细胞房先冲洗一次 ，再拿上去处理。细胞房专用的枪头灭菌，双层报纸包扎。使用过的吸管移液管酸缸浸泡，洗好后灭菌，烘干，管口塞棉花，放入筒内，灭菌，烘干，从烘箱拿出后就即时拿入细胞房，否则放烘箱不拿出来。（减少带菌途径）
protocol-抗肿瘤细胞试验配制培养基(500 mL)：
1、 配制：称取RPMI-1640培养基粉末5.2 g，NaHCO3 1 g加入到事先灭过菌的蓝盖瓶（内含搅拌子），加入约450 mL的双蒸水，避光磁力搅拌1~2 h。
2、 除菌前准备：将牛血清蛋白从-20℃冰箱中拿出放4℃自行冻融。将100 mL注射器、0.22μm滤头、无菌空蓝盖瓶（瓶盖带锡箔纸，用于盛过滤后的无菌培养基）及溶解好的培养基，外包装喷洒酒精后放台内，UV照射1 h。
3、加抗生素：将5mL二抗（青霉素和链霉素）（之前配制好并经0.22μm过滤除菌，青霉素0.3125 g，链霉素0.5 g，50 mL双蒸水溶解）加入培养基，混匀。
4、过滤除菌：拔下注射器的针头，拉出注射器的注射挡管倒立放置桌面 ，插上滤头，倒入约100 mL的将要过滤除菌的培养基，注射器对着空蓝盖瓶，一只手扶住注射器与瓶口交接的地方，装入注射挡管，压入过滤，之后用酒精棉擦拭瓶口（如果滤头堵塞了可换新的滤头）。
5、补加牛血清：加入牛血清50 mL，混匀，标记FBS，日期。放置上层冰箱4℃ 待用。放回抗生素和牛血清于-20℃冰箱。
protocol-下细胞（复苏）：
1、 将培养基置于37℃水浴锅中，将50 mL离心管（凡是用到离心管，自带喷过酒精的封口膜）放入台内，UV照射。
2、 戴手套，将培养基瓶外喷洒酒精后放入台内，从液氮罐内拿出细胞保藏管。
3、 拿出细胞保藏管后37℃水浴锅中解冻，剧烈反复旋转于水中 ，使细胞快速冻融。
4、 细胞保藏管喷洒酒精，拿入台内（首次进台操作时，自带喷洒酒精的棉花，擦台面，揭开所有的盖子，吸管筒，离心管，细胞保藏管）。
5、 预先开好离心机（已调好的，室温下，1000转，5分钟）。
6、 往离心管加培养基8mL/ 管，把细胞保藏液全部转入管内，打匀，封封口膜，平衡离心。
7、 离心完毕，喷洒酒精后，台内抽弃离心管内上清，往离心管加培养基8mL/ 管，打匀（不要吸完，也不要打完，这样不会产生气泡）。注意不同细胞之间操作要换管，防止交叉感染。
8、 将一次性无菌培养皿拿出，在皿盖上标记细胞种类，日期，保细胞者。将离心管内液体全部转入平皿中，盖上皿盖后水平轻轻晃匀（有必要时作空白对照检测是否染菌）。
9、 显微镜观察细胞，有的活细胞可能数量非常少。
10、放置细胞培养箱，3小时内不要移动培养皿，让细胞较好地贴壁。5、6小时后如果细胞贴壁情况良好，可以进行换液。但一般是次日开始换液。
关键词：抗肿瘤细胞试验 肿瘤细胞试验 protocol